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L'origine dell'ospedale è strettamente connessa con la figura di Margherita da Cortona,poi fatta santa, che, dopo avverse vicende personali, si dedicò completamente alla cura dei miserabili e degli infermi. Grazie all'aiuto di Uguccio Casali, signore di Cortona, e di Madonna Diabella, Margherita fondò un ospizio che divenne nel 1286 l'Ospedale di S. Maria della Misericordia. Nel XV secolo sorse poi la necessità di istituire un unico ospedale che riunisse tutti i piccoli ospizi urbani ed extraurbani (S. Caterina, SS. Iacopo e Antonio, S. Nicola, S. Maria, S.Vincenzo e S. Iacopo) a quello maggiore di S. Maria della Misericordia. Così nel novembre del 1441 venne posta la prima pietra per la fabbrica del nuovo ospedale; tale costruzione si protrasse nel tempo, ma già nel 1444 fu attuato il trasferimento dell'Ospedale dalla vecchia Casa della Misericordia al nuovo stabile. Nel secolo successivo Leone X, con la Bolla del 25 aprile 1514, approvò l'unione all'Ospedale di una Cappella, sotto il titolo del SS. Salvatore, nella quale si potessero accogliere i fanciulli esposti e abbandonati; a partire da questi anni l'ospedale venne così a svolgere la duplice funzione di assistenza ai malati e ai gettatelli. Nel 1787 all'ospedale fu aggregato il Conservatorio della SS. Concezione, anche se le due amministrazioni rimasero separate ed unificate soltanto dalla figura del Rettore dell'Ospedale che riuniva in sé anche la carica di Operaio Superiore del Conservatorio. In base alla legge del 17 luglio 1890 gli Ospedali Riuniti di S. Maria della Misericordia furono posti sotto la tutela diretta della Giunta Provinciale Amministrativa alla quale spettava la gestione completa dell'attività amministrativa del nosocomio.